Mécanismes moléculaires des propriétés anti hépatotoxiques et antivirales (virus de l’hépatite C)des composés actifs isolés de Khaya grandifoliola C.DC (Meliaceae)

Abstract

Le but de ce travail a été d’étudier les mécanismes moléculaires des propriétés anti hépatotoxiques et anti-VHC des composés actifs isolés de K. grandifoliola. A cet effet, l’extrait organique de K. grandifoliola a été préparé par macération de la poudre des écorces dans le système solvant chlorure de méthylène/méthanol (v/v). Ensuite, la fraction au chlorure de méthylène/méthanol (75:25, v/v), préparée par chromatographie flash à partir de l’extrait organique a été sous-fractionnée par chromatographie sur colonne de gel de silice et les activités anti-hépatotoxiques et anti-VHC des sous-fractions étudiées. S’agissant de l’activité anti-hépatotoxique des sous-fractions, les modèles d’hépato toxicité induite par le tétrachlorure de carbone (CCl4), le cis platine et le paracétamol (APAP) dans les hépatocytes L-02 ont été utilisés. Les tests de viabilité cellulaire au bromure de 3-(4.5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) et de l’intégrité membranaire en mesurant l’activité de l’alanine aminotransférase (ALAT) libérée dans le milieu d’incubation ont été réalisés. Les composés constitutifs ont été purifiés des sous-fractions actives et les structures des composés déterminées. Les propriétés anti-hépatotoxiques des composés isolés ont été évaluées par la suite en mesurant leur effet sur la viabilité cellulaire, l’intégrité membranaire, la génération des espèces oxygénées réactives (EOR), la péroxydation lipidique membranaire et la déplétion du glutathion (GSH) cellulaire. L’expression du cytochrome P450 2E1 (CYP2E1), la phosphorylation du c-Jun N-terminal Kinase (JNK), la translocation mitochondriale du phospho-JNK (p-JNK), l’expression du Mitogen-activated Protein Kinase Phosphatase-1(Mkp-1) et la translocation nucléaire du Nuclear Factor Erythroid 2-related Factor-2 (Nrf2) ont été évaluées par western blot. L’expression des enzymes antioxydants: catalase (CAT), superoxyde dismutase-1 (SOD1) et glutathion-S-transférase (GST) a été quantifiée par quantitative real time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). La silymarine et le JNK inhibitor SP600125 ont été utilisés comme composés de référence. Concernant l’activité anti-VHC des composés isolés, ceux-ci ont étés testés sur le cycle infectieux du VHC dans la lignée cellulaire Huh7.5 en utilisant le système infectieux VHCcc. Les taux d’infection et de réplication ont été évalués par mesure de l’activité de la luciférase et par immunofluorescence. L’analyse de l’expression des protéines cellulaires [récepteur CD81; Class III phosphatidylinositol 4-kinase alpha (PI4KA); 2’,5’- oligoadenylate synthase-3 (OAS-3) et diacylglycerol acyltransferase-1 (DGAT1)] et virale (NS5B) a été fait par cytométrie de flux et par western blot. Le Danoprevir et l’anticorps anti-CD81 ont été utilisés comme composés de référence. Comme résultats, trois limonoïdes connus, dénommés 17-épiméthyl-6-hydroxylangolensate, 7-deacétoxy-7-oxogedunine et deacétoxy-7Rhydroxygedunine responsables des activités anti-hépatotoxique et anti-VHC ont été isolés des sous-fractions actives. Ces limonoïdes protègent les hépatocytes L-02 contre l’hépato toxicité induite par le CCl4, le cisplatine et l’APAP principalement en inhibant les dommages oxydatifs, la surexpression du CYP2E1, la phosphorylation du JNK et la translocation mitochondriale du p-JNK induits par ces agents toxiques; et en induisant la translocation nucléaire du Nrf2, l’expression du Mkp-1 et des ARNm des enzymes antioxydants: CAT, SOD1 et GST. Les limonoïdes inhibent l’infection au VHC à travers au moins deux étapes de son cycle infectieux, l’entrée et la réplication. Ces composés inhibent l’entrée du VHC en diminuant l’expression du récepteur membranaire CD81. L’inhibition de la réplication virale a été associée à la diminution de l’expression de la protéine virale NS5B, du facteur hôte PI4KA et à l’induction de la protéine antivirale OAS-3. Ces résultats contribuent à la valorisation de K. grandifoliola comme source de composés potentiels pour le traitement des hépatites.